Práctica PCR

MATERIAL 

· 1 Tubo ependorf
· Tubo de cristal 5ml
· Pipetas de 2 y 3 ml
· Micropipetas
· Gradillas
· Microcentrifuga 

REACTIVOS 

· Solución salina
· Matriz instagene
· Tubo Ready to Go
· Oligo1
· Oligo2

TÉCNICA

1.                  Con un isopo o palillo frotamos  en las paredes de la boca para recoger CÉLULAS DE LA MUCOSA BUCAL

2.                  Lo metemos en 3 ml solución salina en tubo y agitamos durante unos segundos, para pasar todo el material genético a la solución salina.

3.                  Después con una pipeta pasamos 1,4 ml a un microtubo  (eppendorf)

4.                  Ponemos en la microcentrifuga a 8000 rpm/ 5 min.

5.                  Decantar sobrenadante con couidado

6.                  Añadimos 70 µl MATRIZ  INSTAGENTE y resuspender (mezclar) con la punta de la micropipeta

7.                  Incubar 10 min. A 100 ºC  en baño seco

8.                  Enfriar a Tº ambiente

9.                  Centrifugar 1300 rpm/ 30 seg

10.              Pasar 10 µl sobrenadante a microtubo → CONGELADOR

11.              Tubo Ready to Go PCR

12.              Añadimos 18,5 µl de agua destilada

13.              Añadimos 2 µl de oligo1

14.              Añadimos 2 µl de oligo2

      15.             Añadimos 2,5 µl de ADN

16.              Un golpe de centrifugamos

17.              Lo metemos en  el PCR, en el cual ira subiendo y bajando la temperatura para desnaturalizar y romper la cadena de ADN y volver a hacer una copia de de ADN únicamente del fragmento que queremos (ya esto está hecho con los reactivos que hemos añadido), esta operación durara sobre unas 2 horas.

HACEMOS GEL DE AGAROSA

1)      Echamos 3  ml de tampón TAE 10 x ( Tris Acetato Edta 10 x )

2)      Echamos 27 ml de agua destilada

3)      Echamos 0,45 gr. De agarosa

4)      Con toda la mezcla anterior (pasos 1,2 y 3) obtenemos una dilución al 1,5 % de agarosa.

5)      Cogemos la mezcla y la calentamos durante al menos 20 seg. Sacamos y movemos, si no se ha disuelto repetimos la operación hasta que esté bien disuelto.

6)      Cuando se ha disuelto bien dejamos que baje la temperatura, (a temperatura ambiente ), y añadimos SOLUCIÓN COLORANTE DE ÁCIDO NUCLÉICO 2 ml.

 MUESTRA

• Primer ependorf:9 ul de ADN replicado + i ul de tampón de carga
• Segundo ependorf: 4.5 ul de ladder + 0.5 ul de tampón de carga

Técnica 

 

1.Colocamos cinta adhesiva en la cubeta donde se va a depositar agarosa

2.Depositamos agarosa lentamente para que no se produzcan burbujas y lo dejamos actuar unos 30 minutos aproximadamente

3.Retiramos las dos peines y lo colocamos en la bandeja de fuente de alimentación .

4.Los palillos deben estar en cátodo , y la muestra debe moverse hacia el ánodo

5.Añadimos el tampón TAE

6.Añadimos control en las esquinas

7.A continuación ,depositamos en pocillos la muestra , 9 ul de DNA + 1 ul de tampón de carga.

8.Una vez llenados los palillos conectamos los cables en la fuente de alimentación y aplicamos una corriente de 120 voltios durante 30 minutos

9.Visualizamos los fragmentos de ADN  en luz ultravioleta