viernes, 12 de junio de 2015

DETERMINACIÓN FUNCIONAL DEL FIBRINÓGENO



Fundamento 

Realizar una determinación cronométrica de fibrinógeno, según el método de von Clauss (se basa en la medición del tiempo que tarda un exceso de trombina en degradar a fibrina el fibrinógeno presente en un PPP diluido y, por tanto, en forma de coágulo).

Material

Gradilla, tubos de ensayo de plástico, micropipeta, puntas de micropipetas, rotulador de vidrio, cubetas de coagulómetro, trocitos de acero para las cubetas, coagulómetro, bolígrafo, hoja milimetrada.

Reactivos: 
  • R1 (trombina bovina)
  • R2 (tampón imidazol)
  • R3 (solución caolín)
  • Coagulation cal
Muestra: 
  • PPP (plasma pobre en plaquetas) 
Desarrollo: 
-Preparamos una dilución 1/10 de la muestra y los controles en Tampón Imidazol (0'05 ml de muestra + 0'45 ml de tampón imidazol).
-Preparamos las diluciones del calibrador en tampón imidazol:

-Colocamos 5 trocitos de acero en las cubetas del coagulómetro, perfectamente rotuladas, y le añadimos 0'2 ml de cada dilución y de la muestra, cada uno respectivamente en su cubeta rotulada.

-Añadimpos 0'02 de R3 en cada cubetas y lo atemperamos, en la placa calefactora entre 4 y 6 minutos.

-Vamos introduciendo, consecutivamente, cada una de las cubetas en la celda de medida del coagulómetro y le añadimos 0'1 ml de R1 (sin atemperar).

-Antomos0 los tiempos y realizamos una curva de actividad con las diluciones del calibrador y luego colocamos la muestra.

Resultados: 




Interpretación de los resultados
 Los valores normales de la fibrinogenemia oscila entre los 150 mg/dl y los 450 mg/dl. Nuestra muestra está por debajo de esos valores normales (más o menos 58) , que puede deberse a trastornos congénitos a  ( fibrinogemia congénita) o adquiridos (hepatopatías).
Hoja de trabajo:
1.   ¿De qué tipo es la determinación de fibrinógeno realizada en esta práctica?

Es una determinación funcional de fibrinógeno.

2.   ¿A qué concentración esta la trombina bovina? 

Está a una concentración de 100 U NIH/ml.

3.   ¿A qué dilución se somete a la muestra? 

La muestra se somete a una dilución de 1/10.

4.   ¿Cuál es la fibrinogenemia normal? 

La fribinogenemia normal oscila entre los 150 y los 450 g/dl.

Preparación de hematíes tipados

PREPARACIÓN DE LA SUSPENSION DE HEMATIES TIPADOS

  1. Tomar 1 ml de sangre ABO conocida y completar con solución salina 3 ml
  2. Centrifugar 4 min. a 2000 rpm.
  3. Quitar sobrenadante
  4. Volver a añadir 3 ml de solución salina y centrifugar y quitar sobrenadante 2 veces más.(en total añadimos, centrifugamos y retiramos sobrenadante 3 veces).
  5. Preparar hematíes al 2%, lo haremos añadiendo en un tubo 2 gotas de hematíes y 5 ml de solución salina

Práctica PCR



MATERIAL 

· 1 Tubo ependorf
· Tubo de cristal 5ml
· Pipetas de 2 y 3 ml
· Micropipetas
· Gradillas
· Microcentrifuga
 

REACTIVOS 
· Solución salina
· Matriz instagene
· Tubo Ready to Go
· Oligo1
· Oligo2



TÉCNICA

1.                  Con un isopo o palillo frotamos  en las paredes de la boca para recoger CÉLULAS DE LA MUCOSA BUCAL
2.                  Lo metemos en 3 ml solución salina en tubo y agitamos durante unos segundos, para pasar todo el material genético a la solución salina.
3.                  Después con una pipeta pasamos 1,4 ml a un microtubo  (eppendorf)
4.                  Ponemos en la microcentrifuga a 8000 rpm/ 5 min.
5.                  Decantar sobrenadante con couidado
6.                  Añadimos 70 µl MATRIZ  INSTAGENTE y resuspender (mezclar) con la punta de la micropipeta
7.                  Incubar 10 min. A 100 ºC  en baño seco
8.                  Enfriar a Tº ambiente
9.                  Centrifugar 1300 rpm/ 30 seg
10.              Pasar 10 µl sobrenadante a microtubo → CONGELADOR
11.              Tubo Ready to Go PCR
12.              Añadimos 18,5 µl de agua destilada
13.              Añadimos 2 µl de oligo1
14.              Añadimos 2 µl de oligo2
      15.             Añadimos 2,5 µl de ADN
16.              Un golpe de centrifugamos
17.              Lo metemos en  el PCR, en el cual ira subiendo y bajando la temperatura para desnaturalizar y romper la cadena de ADN y volver a hacer una copia de de ADN únicamente del fragmento que queremos (ya esto está hecho con los reactivos que hemos añadido), esta operación durara sobre unas 2 horas.

HACEMOS GEL DE AGAROSA

1)      Echamos 3  ml de tampón TAE 10 x ( Tris Acetato Edta 10 x )
2)      Echamos 27 ml de agua destilada
3)      Echamos 0,45 gr. De agarosa
4)      Con toda la mezcla anterior (pasos 1,2 y 3) obtenemos una dilución al 1,5 % de agarosa.
5)      Cogemos la mezcla y la calentamos durante al menos 20 seg. Sacamos y movemos, si no se ha disuelto repetimos la operación hasta que esté bien disuelto.
6)      Cuando se ha disuelto bien dejamos que baje la temperatura, (a temperatura ambiente ), y añadimos SOLUCIÓN COLORANTE DE ÁCIDO NUCLÉICO 2 ml.

 MUESTRA

  • Primer ependorf:9 ul de ADN replicado + i ul de tampón de carga
  • Segundo ependorf: 4.5 ul de ladder + 0.5 ul de tampón de carga
Técnica 
 
1.Colocamos cinta adhesiva en la cubeta donde se va a depositar agarosa
2.Depositamos agarosa lentamente para que no se produzcan burbujas y lo dejamos actuar unos 30 minutos aproximadamente
3.Retiramos las dos peines y lo colocamos en la bandeja de fuente de alimentación .
4.Los palillos deben estar en cátodo , y la muestra debe moverse hacia el ánodo
5.Añadimos el tampón TAE
6.Añadimos control en las esquinas
7.A continuación ,depositamos en pocillos la muestra , 9 ul de DNA + 1 ul de tampón de carga.
8.Una vez llenados los palillos conectamos los cables en la fuente de alimentación y aplicamos una corriente de 120 voltios durante 30 minutos
9.Visualizamos los fragmentos de ADN  en luz ultravioleta
 

Practica XLV Determinación rápida de hemoglobina






Fundamento


Esta determinación rápida de HB se basa en el hecho de que una sangre una concentración HB superior a la permitida para poder efectuar una relación tiene una densidad mayor a la de la solución de sulfato de cobre previamente preparada por lo que en esta circunstancia una gota de la sangre investigada que libremente a través de la solución de sulfato de cobre

Material necesario

Material de extracción de sangre capilar
Un vaso de precipitado de 50 mililitros


Reactivos

Solución de sulfato de cobre a una densidad de 1, 052 gr/dl  para mujeres y 1,054 para hombres gr/dl.

Para ello lo hacemos de la siguiente forma primero y sobre 17 gramos de sulfato de cobre en 100 mililitros de agua destilada solución madreMezclar 51 ml de la solución madre con 49 ml de agua destilada.

Muestra
  • sangre capilar
Técnica
  1.  Disponer la solución de sulfato de cobre en un vaso de precipitado de 50 mililitros
  2.  Recoger una gota de la sangre problema
  3. Dejar caer la gota de la sangre problema con algo de impulso sobre la solución de sulfato de cobre

Lectura de resultados

Si la gota de sangre problema es más densa que la solución de sulfato de cobre que libremente a través de ella.
Sin embargo si la gota de sangre problema es menos densa que la solución de sulfato de cobre no caer al fondo del vaso de precipitados que contiene esta solución.

Interpretación de los resultados

Una gota de sangre con más de 12 gr/dl de HB tiene una densidad mayor que 1, 052 gramos/cm3.

Si la gota de sangre problema cae libremente a través de la solución de sulfato de cobre tiene una densidad mayor que 1,52 gramos por centímetro cúbico y por lo tanto tiene una concentración de HB superior a 12 gramos por decilitro.

Si la sangre problema tiene una concentración de HB superior a 12 gramos por decilitro el sujeto puede donar sangre.

En el caso contrario la donación no puede ser efectuada.

Hoja de trabajo

1¿Cuál es el valor mínimo de hemoglobina que debe tener una mujer antes de la donación? 12,5 g/dl en mujeres.
2. ¿Con qué otra solución comparamos la densidad de la sangre? Con solución de sulfato de cobre.

Práctica LXIV prueba cruzada mayor

Fundamento

consiste en enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso,y por último frente al suero antiglobulina de Coombs

con este último paso detectar hemos los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria

es importante respetar los tiempos de incubación para evitar posibles errores en la técnica


material necesario


tubos de hemólisis
centrífuga
baño de agua
pipetas Pasteur
gradilla
reloj


reactivos

solución salina fisiológica
albúmina bovina al 30 por ciento
suero antiglobulina de Coombs


muestra


suero del receptor, obtenido de sangre coagulada y libre de hemólisis. Debe ser fresco y conservado a 4 grados

hematíes del donante, previamente lavados tres veces en solución salina fisiológica ir de suspendidos en ella al 2-5 por ciento.


técnica


en un tubo de hemólisis depositamos una gota de la suspensión de hematíes del donante y dos gotas del suero del receptor

mezclamos suavemente, y dejamos a temperatura ambiente durante 2 minutos

centrífuga mos a tres mil quinientas revoluciones durante 30 segundos

leemos el resultado obtenido en medio salino

añadimos al tubo tres gotas de albúmina bovina al 30 por ciento

mezclamos bien e incubamos a 37 grados durante 30 minutos

centrífuga mos a tres mil quinientas revoluciones durante 30 segundos


leer el resultado obtenido en medio albuminoso

la vamos tres veces los hematíes con solución salina para eliminar los anticuerpos que no se han fijado a los eritrocitos retirar bien todo el sobrenadante del último lavado.

añadimos al tubo una gota de suero antiglobulina humana de Coombs

mezclar bien y centrífuga a 1000 revoluciones durante 2 minutos y leer los Resultados


lectura de resultados

la lectura de los resultados se realiza resus pendiendo el botón hemático con suavidad después de cada una de las centrifugación es
en caso de reacciones débiles positivas, conviene observar al microscopio entre porta y cubre con objetivo de 40X


interpretación clínica de los resultados obtenidos


la ausencia de aglutinacion en todos los pasos indica que las sangres son compatibles, y por lo tanto, la transfusión se puede hacer

la aglutinacion en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad

si se observa hemólisis en cualquiera de los pasos, también es signo incompatibilidad

en ocasiones es conveniente realizar esta prueba en medio enzimatico

dado que el empleo de enzimas como la bromelina o la papaína refuerza las reacciones antígeno anticuerpo, esta prueba se usa para examinar a los receptores que han sufrido reacciones transfusionales

valoración de los resultados

las sangres analizadas son :
incompatibles.

Práctica LXII: DETERMINACIÓN DE UN Du

Fundamento

El Du es un antígeno d débil que no se pone de manifiesto en las pruebas normales de determinación del RH por ello debemos sensibilizar previamente los hematíes problema con un suero que contiene anticuerpos anti D y posteriormente enfrentarlos al suero de Coombs

Sí existe el antígeno Du en la superficie de los eritrocitos se producirá la unión de los anticuerpos anti D a sus receptores de membrana y en la segunda fase darán lugar a la alucinación en presencia del suero antiglobulina humana es una prueba de Coombs indirecta

material necesario

tubos de centrífuga o de hemólisis
centrífuga
pipetas Pasteur
gradilla
baño de agua
reloj

reactivos

suero anti D humano
suero antiglobulina humana de conejo suero de Coombs
solución salina fisiológica

muestra

hematíes de la sangre problema previamente lavados tres veces en solución salina fisiológica y suspendidos 5 por ciento en dicha solución

técnica


en un tubo de hemólisis colocamos una gota de suero anti D y una gota de la suspensión de hematíes al 5 por ciento

mezclamos suavemente E incubamos durante 30 o 45 minutos

después de incubar lavamos los hematíes en solución salina después del último lavado

añadimos sobre el sedimento hemático una gota de suero de Coombs y mezclamos suavemente

centrífugamos el tubo a 1000 revoluciones durante un minuto

lectura de resultados

observamos la aparición Ono de aglutinación mediante golpes suaves en el fondo del tubo en caso de duda observamos al microscopio entre porta y cubre con el objetivo de 40X.


interpretación clínica de los resultados obtenidos

si existe aglutinacion el resultado es positivo. Indica que en la membrana de los hematíes antígeno d u y se clasifica la sangre como Rh positivo varianted u

en el caso de no existir aglutinacion se clasifica la sangre como Rh negativo para evitar falsos positivos debido a una sensibilización previa de los hematíes in vivo. debemos realizar una prueba de Coombs directa con los hematíes problema

esto nos servirá como control negativo


valoración de los resultados

la sangre es Rh positivo

jueves, 11 de junio de 2015

Practica LXI : determinación del genotipo y fenotipo

fundamento

podemos investigar el genotipo del sistema Rh enfrentando los pies problema a distintos antisuero dirigidos contra los antígenos que componen el sistema Rh.

la existencia o no de estos antígenos en la superficie de los hematíes se detecta por una reacción de aglutinacion.

los resultados de estas acciones se trasladan a una tabla donde podemos ver los posibles genotipos correspondientes.


material necesario


tubos de centrífuga
centrífuga
rotulador de vidrio
pipetas Pasteur desechables
gradilla


Reactivos

suero anti D
suero anti E
suero anti C
suero anti e
suero anti c
solución salina fisiológica

muestra

suspensión de hematíes lavados al 5 por ciento en solución salina fisiológica


técnica

procedemos al lavado de los hematíes y a preparar su suspensión al 5 por ciento según la técnica descrita en la práctica anterior

rótula most 5 tubos de centrífuga Cuba cada uno con la letra D,C,E, c y e.

en cada tubo añadimos una gota del antisuero correspondiente y una gota de la suspensión de hematíes al 5 por ciento y homogeneizamos suavemente

centrífugamoccentrífugamos todos los tubos durante un minuto a mil revoluciones por minuto

lectura de resultados

golpeamos suavemente con el pulpejo de los dedos medio y anular en el fondo de los tubos para despegar el sedimento hemático

el resultado positivo es la presencia de aglutinacion y se observa con la presencia de grumos rojo sobre un fondo claro

la ausencia de aglutinación es un resultado negativo y se observa como la suspensión homogénea de los hematíes en un líquido rojizo.


interpretación clínica de los resultados obtenidos


un resultado positivo indica la presencia del antígeno del sistema Rh buscado en ese tubo

el resultado negativo indica lo contrario

los 5 resultados obtenidos expresa el genotipo de la sangre analizada y se comparan con los contenidos en la tabla de fenotipos y genotipos del sistema Rh que se encuentra en la figura anterior

esto es así porque si la sangre analizada es Rh negativo se puede determinar su único genotipo  posible con respecto al Rh.si la sangre es Rh positivo existen varios genotipos posibles que dan lugar al fenotipo previamente detectado.


hoja de trabajo


¿Que antisuero se utilizan en esta técnica?

¿porque no existe suero anti D?

¿que expresan los resultados obtenidos?

si la sangre es Rh positiva¿puede determinarse exactamente su genotipo con respecto al sistema Rh?




Práctica LX : Determinación del grupo Rh en tubo

fundamento

al igual que en la prueba el portaobjetos, intentamos poner de manifiesto la presencia del antígeno d en la superficie de los hematíes mediante su enfrentamiento a un suero anti D

material necesario

tubos de centrífuga
rotulador de vidrio
gradilla
pipetas Pasteur
centrífuga

reactivos

suero anti D
albúmina bovina al 30 por ciento
solución salina fisiológica al 0,9 por ciento


muestra

hematíes problema preparados en suspensión al 5 por ciento

antes de proceder a suspender los hematíes debemos lavar los tres veces en solución salina fisiológica

para ello tomamos un volumen aproximado de 0,5 mililitros de la sangre problema y la llevamos a un tubo de centrífuga

complementamos el tubo con solución salina y agitamos suavemente para re suspender los hematíes

centrífugamos durante 4 minutos a 2000 revoluciones por minuto. Posteriormente retiramos el sobrenadante y repetimos el proceso dos veces más

el sedimento hemático resultante se re suspende en la cantidad de solución salina necesaria para obtener una suspensión al 5 por ciento


técnica


rotulados dos tubos limpios con las letras d y a

en el tubo d añadimos una gota de suero anti D y el tubo ponemos una gota de albúmina bovina al 30 por ciento

a cada tubo le añadimos una gota de la suspensión de hematíes al 5 por ciento. Agitamos suavemente para mezclar el contenido de los tubos .

centrífugamos durante un minuto a mí las revoluciones por minuto O 30 segundos a tres mil quinientas revoluciones por minuto


lectura de resultados


con el pulpejo de los dedos medio y anular golpeamos suavemente el fondo de los tubos para despegar el botón hemático

se considera aglutinacion positiva si se forman grumos de color rojo en un líquido claro

por el contrario, si se re suspenden homogéneamente los hematíes, decimos que la agudización es negativa.

el tubo con albúmina es un control negativo y deberá siempre ausencia de Agustín acción. En caso de no ser el resultado de la prueba no es válido.


interpretación clínica de los resultados obtenidos


si el tubo d presenta aglutinacion y el tubo a no, decimos que el paciente es Rh positivo

si no se produce aglutinacion en ninguno de los dos tubos procedemos a incubar ambos a 37 grados durante media hora

posteriormente centrífuga vamos a mil revoluciones por minuto durante un minuto y observamos si existe o no aglutinacion

en el caso de persistir la negatividad comprobaremos que el paciente no posee un d u ( d débil) mediante una prueba de Coombs indirecta

si después de todos estos pasos el resultado es la no aglutinacion, informaremos del paciente es Rh negativo.

hoja de trabajo

¿por qué utilizamos el control de albúmina?

¿qué ocurre si no aparece aglutinacion en el tubo d?

¿qué debemos detectar mediante un Coombs indirecto?

¿cómo se prepara la muestra problema?


resultados obtenidos

aglutinacion en la sección s ( fallida)

valoración de los resultados

la sangre analizada es Rh positivo


Práctica LIX : Determinación del grupo Rh en porta

fundamento

la técnica está basada en la detección del antígeno d .
sobre la superficie de los hematíes problema empleando como reactivo un suero monoclonal humano que contiene anticuerpos anti D

en el caso de que los hematíes contengan el antígeno d se producirá una aglutinacion que puede observarse a simple vista


material necesario

portaobjetos
pipetas Pasteur
rotulador de vidrio
palillos agitadores
visualizador luminoso

reactivos

suero anti D
albúmina bovina al 30 por ciento.


muestra

sangre total anticoagulada.

técnica

dividir el portaobjetos en dos secciones con el rotulador de vidrio y marcar con la letra S suero y otra con la letra A albúmina

en la sección s colocamos dos gotas del suero anti D y en la sección A ponemos dos gotas de albúmina bovina al 30 por ciento

depositamos una gota de sangre en cada una de las secciones y mezclamos con palillos distintos

colocamos el porta sobre el visualizador previamente calentado, hilo balance amos para favorecer la mezcla de sangre y reactivos.

lectura de los resultados


esperamos 2 minutos antes de dar el resultado de la prueba.

aglutinacion positiva aparición de grumos rojos sobre un fondo claro. No deben confundirse con pequeños coágulos de fibrina presentes en la muestra .

aglutinación negativa la mezcla da lugar a una suspensión homogenea de los hematíes .

la mezcla de sangre con albumina bovina debe dar siempre aglutinacion negativa. en caso de no ser asi, no podemos informar del resultado de la prueba.

interpretación clínica de los resultados obtenidos

si la sección S es positiva  y la sección A
 Negativa quiere decir Rh positivo si por el contrario la sección S es negativa y la sección A es negativa es Rh negativo

hoja de trabajo

¿qué tipo de muestra empleamos en esta técnica?

¿para qué se utiliza el visualizador?
para observar mejor si hay o no aglutinacion

¿qué puede dar lugar a falsas aglutinaciones?
un mal procedimiento por parte de un mal del técnico

¿qué ocurre si Aglutina la sección a ?


interpretación de los resultados

la sangre analizada es Rh positivo

Practica LVII : Determinación sérica del grupo ABO

fundamento

el suelo de un individuo sólo debe contener anticuerpos frente a los antígenos que no están presentes en sus propios hematíes .

por ello al hacer reaccionar este suero con hematíes conocidos del grupo A y del grupo B sólo producirá aglutinacion sólo produciráaglutinacion en el caso de ser enfrentado a eritrocitos con antígenos distintos a los de sus propios hematíes

esta técnica puede realizarse tanto en porta como un tubo, aunque se prefiere la determinación en tubo porque la centrifugacion de los hematíes intensifica el fenómeno de aglutinacion.

material necesario


tubos de centrífuga
pipetas Pasteur
baño de agua
centrífuga
reloj
rotulador de vidrio
gradilla


reactivos


hematíes del grupo A1
hematíes del grupo A2
hematíes del grupo B
hematíes del grupo 0
hematíes de la sangre problema


muestra


suero obtenido mediante coagulación de la sangre en baño de agua a 37 grados durante 20 a 30 minutos

posteriormente centrífuga Moss durante 10 minutos a 3000 revoluciones por minuto y extraemos el sobrenadante con ayuda de una pipeta Pasteur


técnica


para evitar falsos negativos por la presencia de complemento activo en el suero, es aconsejable la inactivación previa de la muestra. Esto se realiza manteniendo el suero en un baño de agua a 56 grados 10 minutos

con esto evitamos los fenómenos de hemólisis debido al cumplimiento

la vamos tres veces los hematíes propios de la sangre problema con solución salina isotónica según la técnica descrita en la prácticala 28 Posteriormente preparamos una suspensión de estos hematíes al 5 por ciento en solución salina

rótula Moss un tubo de centrífuga con la letra a 1 , otro con la letra A2 otro  b . Otro 0 y otro c.

añadimos a cada tubo dos gotas del suero problema inactiva do

depositamos una gota de la suspensión de hematíes que se corresponda con la letra del tubo rotulado

en el tubo C añadimos una gota de la suspensión de los hematíes propios de la sangre problema, ya que nos servirá de control negativo.

agitamos suavemente y centrífugamos a mil revoluciones por minuto durante un minuto.

lectura de resultados

golpeamos suavemente el extremo inferior de los tubos para despegar el sedimento hemático.

si aparecen unos grumos rojos flotando en un líquido claro indica que existe aglutinacion.

en el caso contrario, y los hematíes se suspenden homogéneamente dando lugar a un líquido de color rojizo.

interpretación clínica de los resultados obtenidos


es difícil confirmar el grupo sanguíneo por esta técnica en el caso de los recién nacidos, ya que sus anticuerpos no están bien desarrollados aun.

también encontramos dificultades en los pacientes con agammaglobulinemia ya que carecen de anticuerpos y en aquellos que poseen otros anticuerpos específicos o inespecíficos capaces de reaccionar con los antigenos del grupo ABO.

discrepancias entre la prueba celular y la serica


en el caso de no tener el mismo resultado en ambas pruebas debemos proceder de la siguiente manera

repetir las pruebas
en el caso de persistir la discrepancia, se obtendrá una nueva muestra de sangre y se realizarán ambas pruebas utilizando hematíes lavados y resuspendidoscorrectamente a la concentración óptima de cada técnica.

efectuar una prueba de Coombs directo sobre los hematíes para detectar posibles autoanticuerpos

realizar la prueba sérica utilizando un panel de screening con hematíes a1. A2. B . 0


causas de la discrepancia entre la prueba celular y sérica


las causas más frecuentes obedecen a tres tipos distintos

1 errores técnicos

identificación incorrecta de las muestras o anotación de los resultados

no añadir todos los reactivos y muestras correspondientes

contaminación de los reactivos o hematíes del panel de screening

proporción inadecuada de muestra y reactivos

sobrecentrifugacion o centrifugación insuficiente

 no valorar la hemólisis considerándola como aglutinacion negativa

2 problemas con la muestra:

presencia de autoanticuerpos

antígenos a o b  débiles

especificidad B adquirida en pacientes A1 por una infección bacteriana

inmunodeficiencias congénitas o adquiridas


hoja de trabajo

1 ¿qué son los hematíes tipaños?
2 ¿a que dilucion empleamos los hematíes del paciente?
3¿qué clase de muestra se emplea en esta técnica?
4¿qué ocurre cuando el tubo c presenta presenta aglaglutinacion?

valoración de los resultados


los anticuerpos encontrados en el suelo son:
anti A1







Practica LVI : Determinacion celular en tubo

Fundamento

los  hematíes problema contienen las sustancias antigénica del sistema ab 0 y se enfrentan a sueros conocidos que posee anticuerpos frente a esos antígenos.

el resultado final es la presencia o no de aglutinacion en los hematíes reaccionantes

material necesario

tubos de centrífuga
rotulador de vidrio
pipetas Pasteur
centrífuga
gradillas


reactivos


suero anti a
suero anti B
suero anti aB
solución salina fisiológica


muestra


sangre total anticoagulada. Para esta técnica es preferible usar una suspensión de los hematíes problema.

técnica


en primer lugar realizamos el lavado de los hematíes problema. Para ello rótulaMos convenientemente un tubo de centrífugay la niña dimos un mililitro de la muestra de sangre. Complementamos el tubo con solución salina agitamos para suspender los hematíes.
centrífugamos 4 minutos a 2000 revoluciones por minuto y le decantamos el sobrenadante

a los hematíes del tubo les añadimos una cantidad suficiente de solución salina como para obtener una suspensión al 2 por ciento. Esto es aproximado, aunque debemos establecer los límites entre el 2 y el 4 por ciento.

rotular tres tubos de ensayo bien limpios con las letras a, By ab.

añadir a cada tubo una gota de la suspensión de hematíes al 2 por ciento.

añadir dos gotas de suero anti a en el tubo a

dos gotas de anti B en el tubo B, y dos gotas de anti a b en el tubo ab

centrífugamos todos los tubos durante un minuto a mil revoluciones por minuto


lectura de resultados


después de centrifugar, golpeamos suavemente el fondo de cada tubo para desprender el sedimento y observar macroscópica mente la presencia o ausencia de aglutinacion

reacción negativa:    los hematíes se re suspenden homogeneamente

reacción positiva: se observa un botón de hematíes que permanecen unidos una vez desprendido el sedimento

interpretación clínica de los resultados obtenidos.


se realiza igual que en la técnica en porta.

es importante destacar que los restos de detergente o sustancias extrañas en los tubos pueden ocasionar falsos negativos

también pueden darse falsos positivos, principalmente por dos motivos:

- aglutinacion no especifica se debe a la presencia de ácido hialurónico en la sangre, procedente de la gelatina de Wharton del cordón umbilical . y se elimina añadiendo una gota de hialuronidasa a la suspensión de hematíes

- fenómeno de rouleaux consiste en una agrupación no especifica de hematíes, que adoptan una imagen de pilas de monedas. Las sustancias que más frecuentemente originan en este fenómeno son

el fibrinogeno , el dextrano polivinilpirrolidona.

estos fenómenos pueden evitarse con el lavado previo de los hematíes problema .


Resultados obtenidos:

La sangre ensayada es del grupo eritrocitario:
B

Practica LV: Determinación celular en porta

fundamento


consiste en observar la aglutinacion de los hematíes enfrentados a una serie de antisuero conocidos y de reconocida eficacia, para determinar el grupo AB0 del individuo


material necesario

un portaobjetos o tarjeta visualizador de fondo blanco

un rotulador de vidrio

una pipeta Pasteur desechable

palillos mezcladores

un reloj

reactivos


suero anti a
suero anti B

muestra


sangre capilar o sangre total anticoagulada, citratada u oxsalatada.


Técnica


dividir un portaobjetos en dos secciones con el rotulador de vidrio. Marcar con una letra A y con la otra b.

depositar una gota de suero anti a azul en la sección a del portaobjetos, ni una gota de suero anti B amarillo en la sección B

situar una pequeña gota de sangre junto a la gota de antisuero

mezclar ambas gotas en cada sección utilizando un palillo distinto en cada una de ellas informando un círculo de 2 centímetros de diámetro

hacer oscilar suavemente el portaobjetos hacia delante y hacia detrás durante 2 minutos

observar la presencia o ausencia de aglutinacion

lectura de resultados

hay alucinación cuando aparecen unos grumos rojos que flotan en un líquido claro. En el caso contrario, los hematíes permanecen en forma de suspensión homogénea de color rojizo.

la presencia o ausencia de aglutinación puede confirmarse mediante examen microscópico de las mezclas.

en general estas pruebas son muy eficaces ya que la presencia de plasma en la muestra aumenta la velocidad de la reacción y el tamaño de los grumos.

el resultado puede observarse en unos segundos, aunque conviene re examinar la relación del anti a . al cabo de dos minutos para comprobar que no se ha pasado por alto ninguna reacción débil. Estás chuleando cubrir en menos de un 1 por ciento de las muestras analizadas

en el caso de que el grupo tenido sea el a .
los hematíes problema deberán ser ensayados de nuevo con lectina anti a de forma que si se produce aglutinacion, el sujeto pertenece al subgrupo a.

resultados obtenidos


La sangre analizada es del grupo eritrocitario

B.








Práctica XL prueba de mezcla con plasma normal

fundamento

la prueba de mezcla con plasma normal se practica generalmente cuando en el plasma problema se termina un TP normal y un TTPA alargado en esta circunstancia se supone que el paciente sufre un déficit de algún factor de la vía intrínseca y en concreto de los 8 .9. 11 o 12 .

para llevarla a cabo se mezcla a partes iguales el PPP problema con ppp normal y se repite la determinación del TTPA pero no en el PPP problema puro y no en la mezcla preparada tras lo cual se incuba la mezcla a 37 grados durante una hora

si el TTPA determinado en la mezcla se corrige faltas en el plasma problema alguno de los factores de la vía intrínseca que sin embargo si está presente en el PPP normal

si el TTPA determinado en la mezcla se corrige faltas en el plasma problema alguno de los factores de la vía intrínseca que sin embargo si está presente en el PPP normal

si el TTPA de lamezcla no se corrige con respecto al del PPP problema puro el transtornos coagula torio se le ve a otros motivos como por ejemplo al actuación de sustancias inhibidoras de la coagulación

material necesario

una gradilla
dos cubetas de coágulo metro
dos trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas
un rotulador de vidrio de punta fina
una pipeta automática capaz de dispensar cero coma un mililitros
cuatro puntas de pipeta automática adecuadas para contener 100 ul
un coagulometro
un baño de agua ajustable a 37 grados
tres tubos de ensayo de plástico


reactivos


una solución de cloruro cálcico 0,0 25 m
una cefalina activada con ácido elagico
un pool de plasmas normales o un plasma control normal

muestra

un plasma pobre en plaquetas ppp correctamente preparado y con un TTPA claramente lo malo es decir alargado a partir del PPP anómalo hay que preparar una dilucion a la mitad con el puzzle plasmas normales o con el plasma control normal esto puede hacerse de la siguiente forma

Ppp anomalo         100 ul
pool plasma o plasma control normal  100ul
dilución           1/2
la dilución de la muestra la mezcla se ha de incubar a 37 grados durante una hora


Técnica


 homogeneizar el cloruro cálcico, la cefalina activada y la dilución de la muestra, Carlos bruscamente.

depositar el volumen total que se va a necesitar del cloruro cálcico de la cefalina activada y de la dilución de la muestra, en tres tubos de ensayo de plástico, adecuadamente rotulados

atemperar los reactivos a 37 grados entre 5 y 15 minutos

tomar dos cubetas de coagulometro e introducir un trocito de acero en cada una de ellas

rotura en el extremo superior de las cubetas de coagulometro con las siglas M1 m2

inverter 100 microlitros de la dilución de la música en cada una de las cubetas

añadir a lo anterior 100 microlitros de cefalina activada

mezclar bien la cefalina activada con el resto del contenido de cada cubeta. Esto puede realizarse en el momento en el que se añade la cefalina activada, mediante la ejecución de aspiraciones y expulsiones sucesivas de la Mezcla con la pipeta automática

incubar la mezcla, contenido en cada cubeta, a 37 grados, durante 2 minutos para ello pueden depositar se las cubetas en la placa calefactora del coagulometro

colocar, sucesivamente, cada una de las dos cubetas en la celda de medida del coagulometro, y agregar 100 mi club microlitros de cloruro cálcico 0,0 25m.

lectura de resultados


el TTPA es el tiempo transcurrido desde la adicción del cloruro cálcico hasta la formación del coágulo de fibrina


como el TTPA de la dilución de la muestra se termina dos veces, se calcula la cifra media de esta pareja de valor. Este valor medio es el resultado final de la determinación

interpretación de los resultados


si el PP es normal y el TTPA está alargado, enfermo, probablemente, parecerá un trastorno de la vía intrínseca.

en este caso, se debe repetir la determinación del TTPA, print cuándo la mezcla del plasma y cefalina activada durante 15 minutos punto si con este cambio se corrige el alargamiento del TTPA, es decir, cetona normal, probablemente, hay un déficit de pk.

cuando estás comentar el tiempo de incubación, no se corrige el TTPA, tiene que hacerse una prueba de mezclas de con plasma normal

si tras la mezcla con plasma normal, el TTPA se corrige, deja de estar al lado, falta algún factor de la vía intrínseca 8. 9. 11.12

en la muestra y su carencia ha sido compensada con el aporte suplementario de factores contenidos en el plasma normal.

si por el contrario tras la mezcla con plasma normal, no se corrige el TTPA, se debe investigar la presencia en el plasma de un inhibidor de la coagulación: heparina .PDF

hoja de trabajo


¿cuando debe hacerse una prueba de mezcla con plasma normal?

si tras la mezcla con plasma normal, no se corrige el TTPA, ¿qué se debe investigar?



Práctica XL Determinación del tiempo de protrombina TP

 fundamento

para construir una curva de actividad de la protrombina se prepara una batería de direcciones a partir de un plasma control normal y se mide el PP del plasma control normal no diluido y de cada una de las dilucionos preparadas
tras ello se asigna el cien por cien de actividad al número de segundos medidos en la determinación del PP del plasma control normalde ac y se calcula el porcentaje que proporcionalmente les corresponde a los valores de TP determinados en cada una de las diluciones de este

con todos estos datos se traza una curva de calibrado curva de actividad de la protrombina anotando en el eje de coordenadas el vertical los valores en segundos del PP del plasma control no diluido y de cada una de sus direcciones y  en el eje de abscisas el horizontal el porcentaje de actividad asignado a cada uno de ellos

material necesario

8 tubos de ensayo de plástico.
un rotulador de vidrio de punta fina
una pre pipeta de seguridad
una pipeta graduada de vidrio de un mililitro de capacidad de dispensación
una pipeta automática capaz de dispensar 100 y 200 ul
siete puntas de pipeta automática adecuadas para contener 100 y 200ul
5 cubetas de coágulometro
cinco trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas
un coágulometro
un baño de agua ajustable a 37 grados
un bolígrafo
una regla
una hoja de papel milimetrado también se puede utilizar un papel gráfico especial
una gradilla

reactivos

solución salina al 0,85 por ciento
una tromboplastina cálcica

un pool de plasmas normales o un plasma control normal
los tubos han de ser rotulados con la cuantía de la dilución que contienen o con el porcentaje de actividad asignado a cada dilucion

Técnica

1 homogeneizar la tromboplastina cálcico y las diluciones de plasma sin agitar las bruscamente
2 depositar el volumen total de tromboplastina calcica que se va a necesitar en un tubo de ensayo de plástico adecuadamente rotulado
3 atemperar la tromboplastina calcica a 37 grados para ello se sitúa el tubo que contiene esta sustancia en un baño de agua ajustado 37 grados entre 5 y 15minutos .
4 introducir un trocito de acero apropiado en 5 cubetas de coagulometro
6 rotular el extremo superior de una cubeta con el porcentaje de actividad de 100l otra con el 50 y el de otra con el 23 y el de otra con el 25 y el de otra con el de
10

verter 100ul de plasma puro y de cada una de sustituciones en el interior de las cubetas rotulada con el porcentaje de actividad que les corresponde
 7 incubar el plasma contenido en cada cubeta a 37 grados entre 5 y 3 minutos para ello pueden depositar se las cubetas en la placa calefactora del coagulometro

8 colocar sucesivamente cada una de las 5 cubeta en la cena de medida del coagulometro y agregar 200ul de tromboplastina cálcica
al agregar la tromboplastinaal agreg se pone en marcha el magneto agitador del coagulometro y comienza la lectura de este
cuando se forma el coágulo en el conometro finaliza la lectura y nos ofrece su pantalla el tiempo transcurrido desde la adicción de la tromboplastina cálcica.

lectura de resultados

el tp es el tiempo transcurrido desde la adicción de la tromboplastina calcica hasta la formación del coágulo de fibrina

lo más correcto es determinar tres veces el TP el plasma control puro y de cada una de sus diluciones y dar como resultado final la cifra media calculada a partir de cada trío de valores

para construir la curva de actividad de la protrombina hay que trazar una curva de calibrado o de referencia en un papel milimetrado para ello se notan en el eje de coordenadas o de las y el vertical los valores en segundos DTP del plasma control no diluido y de cada una de sustituciones y en el eje de las abscisas dónde las X el horizontal el porcentaje de actividad asignado a cada uno de ellos

posteriormente se señalan en la gráfica los puntos en que confluyen cada uno de los valores de Pepe con su porcentaje de actividad correspondiente finalmente se dibujó en la línea que mejor 125. La gráfica se te hace un papel milimetrado normal se obtiene una curva