DETERMINACIÓN FUNCIONAL DEL FIBRINÓGENO

Fundamento 

Realizar una determinación cronométrica de fibrinógeno, según el método de von Clauss (se basa en la medición del tiempo que tarda un exceso de trombina en degradar a fibrina el fibrinógeno presente en un PPP diluido y, por tanto, en forma de coágulo).

Material

Gradilla, tubos de ensayo de plástico, micropipeta, puntas de micropipetas, rotulador de vidrio, cubetas de coagulómetro, trocitos de acero para las cubetas, coagulómetro, bolígrafo, hoja milimetrada.

Reactivos: 

• R1 (trombina bovina)
• R2 (tampón imidazol)
• R3 (solución caolín)
• Coagulation cal

Muestra: 

• PPP (plasma pobre en plaquetas) 

Desarrollo: 
-Preparamos una dilución 1/10 de la muestra y los controles en Tampón Imidazol (0'05 ml de muestra + 0'45 ml de tampón imidazol).
-Preparamos las diluciones del calibrador en tampón imidazol:

-Colocamos 5 trocitos de acero en las cubetas del coagulómetro, perfectamente rotuladas, y le añadimos 0'2 ml de cada dilución y de la muestra, cada uno respectivamente en su cubeta rotulada.

-Añadimpos 0'02 de R3 en cada cubetas y lo atemperamos, en la placa calefactora entre 4 y 6 minutos.

-Vamos introduciendo, consecutivamente, cada una de las cubetas en la celda de medida del coagulómetro y le añadimos 0'1 ml de R1 (sin atemperar).

-Antomos0 los tiempos y realizamos una curva de actividad con las diluciones del calibrador y luego colocamos la muestra.

Resultados: 

Interpretación de los resultados

 Los valores normales de la fibrinogenemia oscila entre los 150 mg/dl y los 450 mg/dl. Nuestra muestra está por debajo de esos valores normales (más o menos 58) , que puede deberse a trastornos congénitos a  ( fibrinogemia congénita) o adquiridos (hepatopatías).

Hoja de trabajo:

1.   ¿De qué tipo es la determinación de fibrinógeno realizada en esta práctica?

Es una determinación funcional de fibrinógeno.

2.   ¿A qué concentración esta la trombina bovina? 

Está a una concentración de 100 U NIH/ml.

3.   ¿A qué dilución se somete a la muestra? 

La muestra se somete a una dilución de 1/10.

4.   ¿Cuál es la fibrinogenemia normal? 

La fribinogenemia normal oscila entre los 150 y los 450 g/dl.

Preparación de hematíes tipados

PREPARACIÓN DE LA SUSPENSION DE HEMATIES TIPADOS

1. Tomar 1 ml de sangre ABO conocida y completar con solución salina 3 ml
2. Centrifugar 4 min. a 2000 rpm.
3. Quitar sobrenadante
4. Volver a añadir 3 ml de solución salina y centrifugar y quitar sobrenadante 2 veces más.(en total añadimos, centrifugamos y retiramos sobrenadante 3 veces).
5. Preparar hematíes al 2%, lo haremos añadiendo en un tubo 2 gotas de hematíes y 5 ml de solución salina

Práctica PCR

MATERIAL 

· 1 Tubo ependorf
· Tubo de cristal 5ml
· Pipetas de 2 y 3 ml
· Micropipetas
· Gradillas
· Microcentrifuga 

REACTIVOS 

· Solución salina
· Matriz instagene
· Tubo Ready to Go
· Oligo1
· Oligo2

TÉCNICA

1.                  Con un isopo o palillo frotamos  en las paredes de la boca para recoger CÉLULAS DE LA MUCOSA BUCAL

2.                  Lo metemos en 3 ml solución salina en tubo y agitamos durante unos segundos, para pasar todo el material genético a la solución salina.

3.                  Después con una pipeta pasamos 1,4 ml a un microtubo  (eppendorf)

4.                  Ponemos en la microcentrifuga a 8000 rpm/ 5 min.

5.                  Decantar sobrenadante con couidado

6.                  Añadimos 70 µl MATRIZ  INSTAGENTE y resuspender (mezclar) con la punta de la micropipeta

7.                  Incubar 10 min. A 100 ºC  en baño seco

8.                  Enfriar a Tº ambiente

9.                  Centrifugar 1300 rpm/ 30 seg

10.              Pasar 10 µl sobrenadante a microtubo → CONGELADOR

11.              Tubo Ready to Go PCR

12.              Añadimos 18,5 µl de agua destilada

13.              Añadimos 2 µl de oligo1

14.              Añadimos 2 µl de oligo2

      15.             Añadimos 2,5 µl de ADN

16.              Un golpe de centrifugamos

17.              Lo metemos en  el PCR, en el cual ira subiendo y bajando la temperatura para desnaturalizar y romper la cadena de ADN y volver a hacer una copia de de ADN únicamente del fragmento que queremos (ya esto está hecho con los reactivos que hemos añadido), esta operación durara sobre unas 2 horas.

HACEMOS GEL DE AGAROSA

1)      Echamos 3  ml de tampón TAE 10 x ( Tris Acetato Edta 10 x )

2)      Echamos 27 ml de agua destilada

3)      Echamos 0,45 gr. De agarosa

4)      Con toda la mezcla anterior (pasos 1,2 y 3) obtenemos una dilución al 1,5 % de agarosa.

5)      Cogemos la mezcla y la calentamos durante al menos 20 seg. Sacamos y movemos, si no se ha disuelto repetimos la operación hasta que esté bien disuelto.

6)      Cuando se ha disuelto bien dejamos que baje la temperatura, (a temperatura ambiente ), y añadimos SOLUCIÓN COLORANTE DE ÁCIDO NUCLÉICO 2 ml.

 MUESTRA

• Primer ependorf:9 ul de ADN replicado + i ul de tampón de carga
• Segundo ependorf: 4.5 ul de ladder + 0.5 ul de tampón de carga

Técnica 

 

1.Colocamos cinta adhesiva en la cubeta donde se va a depositar agarosa

2.Depositamos agarosa lentamente para que no se produzcan burbujas y lo dejamos actuar unos 30 minutos aproximadamente

3.Retiramos las dos peines y lo colocamos en la bandeja de fuente de alimentación .

4.Los palillos deben estar en cátodo , y la muestra debe moverse hacia el ánodo

5.Añadimos el tampón TAE

6.Añadimos control en las esquinas

7.A continuación ,depositamos en pocillos la muestra , 9 ul de DNA + 1 ul de tampón de carga.

8.Una vez llenados los palillos conectamos los cables en la fuente de alimentación y aplicamos una corriente de 120 voltios durante 30 minutos

9.Visualizamos los fragmentos de ADN  en luz ultravioleta

 

Practica XLV Determinación rápida de hemoglobina

Fundamento

Esta determinación rápida de HB se basa en el hecho de que una sangre una concentración HB superior a la permitida para poder efectuar una relación tiene una densidad mayor a la de la solución de sulfato de cobre previamente preparada por lo que en esta circunstancia una gota de la sangre investigada que libremente a través de la solución de sulfato de cobre

Material necesario

Material de extracción de sangre capilar

Un vaso de precipitado de 50 mililitros

Reactivos

Solución de sulfato de cobre a una densidad de 1, 052 gr/dl  para mujeres y 1,054 para hombres gr/dl.

Para ello lo hacemos de la siguiente forma primero y sobre 17 gramos de sulfato de cobre en 100 mililitros de agua destilada solución madreMezclar 51 ml de la solución madre con 49 ml de agua destilada.

Muestra

• sangre capilar

Técnica

1.  Disponer la solución de sulfato de cobre en un vaso de precipitado de 50 mililitros
2.  Recoger una gota de la sangre problema
3. Dejar caer la gota de la sangre problema con algo de impulso sobre la solución de sulfato de cobre

Lectura de resultados

Si la gota de sangre problema es más densa que la solución de sulfato de cobre que libremente a través de ella.

Sin embargo si la gota de sangre problema es menos densa que la solución de sulfato de cobre no caer al fondo del vaso de precipitados que contiene esta solución.

Interpretación de los resultados

Una gota de sangre con más de 12 gr/dl de HB tiene una densidad mayor que 1, 052 gramos/cm3.

Si la gota de sangre problema cae libremente a través de la solución de sulfato de cobre tiene una densidad mayor que 1,52 gramos por centímetro cúbico y por lo tanto tiene una concentración de HB superior a 12 gramos por decilitro.

Si la sangre problema tiene una concentración de HB superior a 12 gramos por decilitro el sujeto puede donar sangre.

En el caso contrario la donación no puede ser efectuada.

Hoja de trabajo

1¿Cuál es el valor mínimo de hemoglobina que debe tener una mujer antes de la donación? 12,5 g/dl en mujeres.
2. ¿Con qué otra solución comparamos la densidad de la sangre? Con solución de sulfato de cobre.

Práctica LXIV prueba cruzada mayor

Fundamento

consiste en enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso,y por último frente al suero antiglobulina de Coombs

con este último paso detectar hemos los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria

es importante respetar los tiempos de incubación para evitar posibles errores en la técnica


material necesario


tubos de hemólisis
centrífuga
baño de agua
pipetas Pasteur
gradilla
reloj


reactivos

solución salina fisiológica
albúmina bovina al 30 por ciento
suero antiglobulina de Coombs


muestra


suero del receptor, obtenido de sangre coagulada y libre de hemólisis. Debe ser fresco y conservado a 4 grados

hematíes del donante, previamente lavados tres veces en solución salina fisiológica ir de suspendidos en ella al 2-5 por ciento.


técnica


en un tubo de hemólisis depositamos una gota de la suspensión de hematíes del donante y dos gotas del suero del receptor

mezclamos suavemente, y dejamos a temperatura ambiente durante 2 minutos

centrífuga mos a tres mil quinientas revoluciones durante 30 segundos

leemos el resultado obtenido en medio salino

añadimos al tubo tres gotas de albúmina bovina al 30 por ciento

mezclamos bien e incubamos a 37 grados durante 30 minutos

centrífuga mos a tres mil quinientas revoluciones durante 30 segundos


leer el resultado obtenido en medio albuminoso

la vamos tres veces los hematíes con solución salina para eliminar los anticuerpos que no se han fijado a los eritrocitos retirar bien todo el sobrenadante del último lavado.

añadimos al tubo una gota de suero antiglobulina humana de Coombs

mezclar bien y centrífuga a 1000 revoluciones durante 2 minutos y leer los Resultados


lectura de resultados

la lectura de los resultados se realiza resus pendiendo el botón hemático con suavidad después de cada una de las centrifugación es
en caso de reacciones débiles positivas, conviene observar al microscopio entre porta y cubre con objetivo de 40X


interpretación clínica de los resultados obtenidos


la ausencia de aglutinacion en todos los pasos indica que las sangres son compatibles, y por lo tanto, la transfusión se puede hacer

la aglutinacion en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad

si se observa hemólisis en cualquiera de los pasos, también es signo incompatibilidad

en ocasiones es conveniente realizar esta prueba en medio enzimatico

dado que el empleo de enzimas como la bromelina o la papaína refuerza las reacciones antígeno anticuerpo, esta prueba se usa para examinar a los receptores que han sufrido reacciones transfusionales

valoración de los resultados

las sangres analizadas son :
incompatibles.

Práctica LXII: DETERMINACIÓN DE UN Du

Fundamento

El Du es un antígeno d débil que no se pone de manifiesto en las pruebas normales de determinación del RH por ello debemos sensibilizar previamente los hematíes problema con un suero que contiene anticuerpos anti D y posteriormente enfrentarlos al suero de Coombs

Sí existe el antígeno Du en la superficie de los eritrocitos se producirá la unión de los anticuerpos anti D a sus receptores de membrana y en la segunda fase darán lugar a la alucinación en presencia del suero antiglobulina humana es una prueba de Coombs indirecta

material necesario

tubos de centrífuga o de hemólisis
centrífuga
pipetas Pasteur
gradilla
baño de agua
reloj

reactivos

suero anti D humano
suero antiglobulina humana de conejo suero de Coombs
solución salina fisiológica

muestra

hematíes de la sangre problema previamente lavados tres veces en solución salina fisiológica y suspendidos 5 por ciento en dicha solución

técnica


en un tubo de hemólisis colocamos una gota de suero anti D y una gota de la suspensión de hematíes al 5 por ciento

mezclamos suavemente E incubamos durante 30 o 45 minutos

después de incubar lavamos los hematíes en solución salina después del último lavado

añadimos sobre el sedimento hemático una gota de suero de Coombs y mezclamos suavemente

centrífugamos el tubo a 1000 revoluciones durante un minuto

lectura de resultados

observamos la aparición Ono de aglutinación mediante golpes suaves en el fondo del tubo en caso de duda observamos al microscopio entre porta y cubre con el objetivo de 40X.


interpretación clínica de los resultados obtenidos

si existe aglutinacion el resultado es positivo. Indica que en la membrana de los hematíes antígeno d u y se clasifica la sangre como Rh positivo varianted u

en el caso de no existir aglutinacion se clasifica la sangre como Rh negativo para evitar falsos positivos debido a una sensibilización previa de los hematíes in vivo. debemos realizar una prueba de Coombs directa con los hematíes problema

esto nos servirá como control negativo


valoración de los resultados

la sangre es Rh positivo

Practica LXI : determinación del genotipo y fenotipo

fundamento

podemos investigar el genotipo del sistema Rh enfrentando los pies problema a distintos antisuero dirigidos contra los antígenos que componen el sistema Rh.

la existencia o no de estos antígenos en la superficie de los hematíes se detecta por una reacción de aglutinacion.

los resultados de estas acciones se trasladan a una tabla donde podemos ver los posibles genotipos correspondientes.


material necesario


tubos de centrífuga
centrífuga
rotulador de vidrio
pipetas Pasteur desechables
gradilla


Reactivos

suero anti D
suero anti E
suero anti C
suero anti e
suero anti c
solución salina fisiológica

muestra

suspensión de hematíes lavados al 5 por ciento en solución salina fisiológica


técnica

procedemos al lavado de los hematíes y a preparar su suspensión al 5 por ciento según la técnica descrita en la práctica anterior

rótula most 5 tubos de centrífuga Cuba cada uno con la letra D,C,E, c y e.

en cada tubo añadimos una gota del antisuero correspondiente y una gota de la suspensión de hematíes al 5 por ciento y homogeneizamos suavemente

centrífugamoccentrífugamos todos los tubos durante un minuto a mil revoluciones por minuto

lectura de resultados

golpeamos suavemente con el pulpejo de los dedos medio y anular en el fondo de los tubos para despegar el sedimento hemático

el resultado positivo es la presencia de aglutinacion y se observa con la presencia de grumos rojo sobre un fondo claro

la ausencia de aglutinación es un resultado negativo y se observa como la suspensión homogénea de los hematíes en un líquido rojizo.


interpretación clínica de los resultados obtenidos


un resultado positivo indica la presencia del antígeno del sistema Rh buscado en ese tubo

el resultado negativo indica lo contrario

los 5 resultados obtenidos expresa el genotipo de la sangre analizada y se comparan con los contenidos en la tabla de fenotipos y genotipos del sistema Rh que se encuentra en la figura anterior

esto es así porque si la sangre analizada es Rh negativo se puede determinar su único genotipo  posible con respecto al Rh.si la sangre es Rh positivo existen varios genotipos posibles que dan lugar al fenotipo previamente detectado.


hoja de trabajo


¿Que antisuero se utilizan en esta técnica?

¿porque no existe suero anti D?

¿que expresan los resultados obtenidos?

si la sangre es Rh positiva¿puede determinarse exactamente su genotipo con respecto al sistema Rh?