PRACTICA XIX : Determinación de la sideremia

Fundamento


En primer lugar el hierro férrico presente en la muestra y unido a la transferrina es liberado por la acción guanidinio.

Seguidamente , el hierro férrico libre es reducido a ferroso por la hidroxiklamina.
Posteriormente , el hierro ferroso reacciona con la ferrozina para producir un complejo coloreado .

Finalmente la intensidad , de formación del complejocoloreado es medida espectrofometricamente .


Material necesario

•  4 tubos de plástico de un sólo uso
• rotulador de vidrio
• 2 pipetas graduadas de un ml
• 1 pipeta automática de 200 micro litros
• puntas de pipeta automática
• 5 cubetas de espectrofotometria
• un espectrofotómetro

Reactivos

• Reactivo 1 
• Tampón  ,            acetato 100 mmol/L

• Es irritante por lo que hay que evitar el contacto con la piel o con los ojos.

• Reactivo 2 
• Reductor      ,     Ácido ascórbico     99,7%

• Reactivo 3
• color   ,     Ferrozine          40 mmol/L

 IRON CAL    ,   patrón primario acuoso de 100 ug / dL

 Se prepara vaciando el contenido de un vial de reactivo 2 en el interior de un bote de reactivo 1 ( tampón )  y agitamos suavemente la mezcla .

es estable 1 meses atemperatura ambiente .




Muestra

• Suero o plasma heparinizado
• No son válidas las muestras hemolizadas.

Técnica

• ajustar el espectrofotómetro a cero con agua destilada

• Llevar los reactivos , el patrón y la muestra a temperatura ambiente o a 37ºC
• Rotular 4 tubos de ensayo con las siglas BR ( blanco de reactivo ) , P ( patrón ) , BM ( blanco de muestra ) y M ( muestra  ) 
•   pipetear a cada tubo lo siguiente :

----------------------	Blanco de reactivo BR	Tubo de patrón P	Blanco de muestra BM	Tubo de muestra M
RT (ml)	1,0	1,0	1,0	1,0
R3 (gotas)	1	1	-	1
agua destilada (ul)	200	-
patrón ( ul )	-	200		-
muestra ( ul)	1	1	200	200

•  Agitar el contenido d los tubos 
• Dejar que reaccionen los componentes de todos los tubos , durante 5 min , a temperatura ambiente 
• Ajustar el espectrofotómetro a 560 nm
• disponer el contenido de los tubos en cubetas de espectrofotometria
• Leer la abssorbancia (A) 

CALCULOS


(A) muestra - (A  ) blanco de muestra
--------------------------------------------------- x 100 ( conc patron ) = ug / dl de hierro
                 ( A) patrón