Electroforesis de hemoglobina

Fundamento

La electroforesis es una técnica analítica que sirve para sepaar las moléculas en función de su carga eléctrica neta. El hemolizado se deposita sobre una tira empapada con un líquido alcalino y se aplica una corriente eléctrica que lo atraviesa. Cuando en un medio básico adquierren una carga eléctrica neta se van desplazando del cátodo al ánodo. En la sangre hay varios tipos de Hb con diferente carga, de modo que se separan en función de dicha carga y a la velocidad proporcional de la misma.

Material necesario

Gradilla
Tubos de ensayo
Vaso precipitado
Pipetas Pasteur
Papel absorbente
Agitador de tubos
Mascarilla
Papel parafilm
Capilar azul
Centrífuga
Pinzas de metal
Cubeta y fuente de alimentación
Bandejas de plástico
Agitador de bandejas
Embudo
Rodillo de metal
Estufa
Lámina de vidrio
Tiras de celulosa

Muestra 

Hemolizado

Reactivos

Agua destilada
Suero salino
Cloroformo
Negro amino y/o Rojo ponceau
Tampón 8,8
Ácido acético al 5%
Metanol
Solución transparentadora

Técnica

Para preparación de hemolizado:

Añadimos 3ml de sangre en un tubo de centrífuga, tapamos con papel parafilm y centrifugamos a 3500 rpm durante 5 minutos. Retiramos sobrenadante con una pipeta pasteur y lo depositamos en un vaso de precipitado.
Después añadimos 4 ml de suero salino con una pipeta Pasteur y homogeneizamos bien. Y centrifufamos de nuevo a 3500 rmp durante cinco minutos. Repetimos el proceso dos veces más.
La tercera vez, retiramos el sobrenadante y obtenemos el sedimento comprobando que la cantidad del mismo es de 1 ml. Le añadimos 0,5 ml de cloroformo y 1,5 de agua destilada. Agitamos la mezcla con un agitador de tubos y tapamos con papel parafilm. Centrifugamos de nuevo pero esta vez, a 3500rpm durante 20 minutos.
Finalmente, retiramos el sobrenadante con una pipeta Pasteur y lo depositamos en un tubo de ensayo colocado en una gradilla. Y ya tenemos nuestro hemolizado, que será la muestra que empleemos para nuestra práctica.

Para electroforesis:

Preparamos en una bandeja tampón 8,8.
Sacamos dos tiras de celulosa con unas pinzas de metal y la introducimos en la bandeja con tampón. De forma que la parte absorbente quede hacia arriba, y la dejamos durante 10 minutos.
Retiramos la tira y la colocamos en un puente, de modo que siga estando en la misma posición. Hay que dejar que sobresalga por ambos lados del puente parte de la tira para que esté en contacto con la solución presente en la bandeja. En la parte donde tiene un corte la tira hacemos una señal con un rotulador de vidrio y depositamos con un capilar azul por encima de la misma una pequeña cantidad de nuestro hemolizado. Introducimos el puente en bandeja de fuente de alimentación de modo que el extremo del corte quede en el lugar del cable negro. Conectamos los cables y programamos aparato a 400 voltios durante 20 minutos.
Sacamos la tira cuidadosamente, y de forma invertica la depositamos en una bandeja con Rojo ponceau durante diez minutos. Para que se tiña bien colocamos la bandeja en un agitador de bandejas.
Pasado ese tiempo la introducimos en una bandeja que contiene acido acetico durante 10 minutos. Esto lo repetimos dos veces mas.
Después colocamos la tira en una bandeja con metanol durante un minuto.
después en otra bandeja con transparentadora durante 3 minutos
A continuación retiramos la tira con unas pinzas de metal y la colocamos en una placa de vidrio. para que quede bien adherida utilizamos un rodillo de metal.
La introducimos en la estufa durante 5 minutos a 60 grados y ya tenemos la práctica realizada y podemos determinar la cantidad y tipos de hemoglobina presentes en la muestra del paciente.